Keita Okada等人的论文发表在英国科学杂志《Nucleic Acids Research》上

先生冈田启太（研究生院生命科学学科硕士课程，2021年毕业）、青木佳苗女士（同一课程2年级学生，广岛市立御砂冈高中毕业）／导师：分子发育调控实验室镰池佑介教授)等人的论文发表在英国科学杂志《Nucleic Acids Research》上。

“核酸研究”是1974 年牛津大学出版社已发布开放获取的评论这是一本科学期刊，其中有DNA是啊RNA等等核酸并发表相关研究论文。

Okada 等人发表的论文标题。是“与野生型或 HiFi Cas9 组装的双引导 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物的 CRISPR RNA 的关键序列特征。”

基因组编辑是利用 DNA 双链断裂后的体内修复功能进行的。目前，CRISPR-Cas9（成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白）*主要用作诱导这种双链断裂的工具。具有DNA双链切割活性的CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物由引导RNA（gRNA）和Cas9蛋白形成，引导RNA（gRNA）由两种短RNA：CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）组成。 CRISPR-Cas9 RNP 对目标 DNA 的识别是通过 Cas9 蛋白与称为 NGG 的 PAM 序列相互作用来实现的，然后 crRNA 与 PAM 序列相邻的互补 DNA 结合。 CRISPR Cas9已成为基因组编辑中的重要工具，因为它易于使用，并且只需改变crRNA序列即可在基因组上的目标位置进行切割。

然而，众所周知，切割效率根据 crRNA 序列而变化，选择具有高切割效率的 crRNA 对于成功的基因组编辑非常重要。常规上，由crRNA和tracrRNA融合而成的单引导RNA（sgRNA）已被广泛使用，但通过体外或体内转录反应合成的sgRNA在5'端具有鸟嘌呤（G），这不仅限制了靶序列的选择，而且显着降低了CRISPR-Cas9的切割效率。以往的研究大多使用sgRNA，因此crRNA序列特征与切割效率之间的关系仍不清楚。

(图1通用基因组编辑方法和CRISPR-Cas9切割方法)

因此，Okada 博士和他的同事决定使用双引导 RNA (dgRNA) 来研究 crRNA 碱基序列和切割效率之间的关系，它同时使用两种 RNA，并且没有 sgRNA 的局限性。

在本实验中，我们为斑马鱼 (Danio rerio) 基因组上的 17 个基因设计了 51 个 crRNA，并测量了切割效率。首先，在受精后立即将由野生型SpCas9（WT Cas9）蛋白或高保真SpCas9（HiFi Cas9）蛋白（一种具有改进特异性的SpCas9变体）组成的RNP复合物显微注射到斑马鱼胚胎中，并在第二天制备胚胎的基因组DNA。当 CRISPR-Cas9 发生切割时，DNA 修复过程中会发生序列删除和插入 (indel)。通过检查 indel 的比例，可以确定每个 crRNA 切割效率的差异。为了研究这一点，使用PCR方法扩增目标序列，并使用桑格测序分析其碱基序列。 PCR 产物除了原始序列外还包含各种插入缺失。因此，通过将其获得的波形数据与原始阵列的波形数据进行比较，就可以知道发生了多少插入缺失。
这项分析使用了名为“分解插入缺失跟踪”(TIDE) 和“CRISPR 编辑推断”(ICE) 的计算机程序。使用另一个称为k-mer概率标志(kpLogo)的计算机程序分析由此获得的51个crRNA的切割效率和靶序列，并根据切割效率计算每个位置的碱基出现频率的统计显着性作为P值。通过进行此分析，我们阐明了crRNA的每个碱基是否增加或减少切割效率的特征（图2显示P值-log₁₀表示为基本徽标，其大小对应于转换为 (P) 的值。

(图2 kp-Logo计算方法及得到的位置特异性序列特征)

先生接手冈田先生研究的青木使用27个新设计的crRNA来研究从51个crRNA的切割效率获得的每个碱基每个位置的P值是否可以用来预测另一个crRNA的活性。对于活性预测，-增加切割效率的碱基的对数₁₀(P)值取为正值，在效率降低的碱基的情况下，将所有位置的总和取为负值，并将其用作CRISPR-kp评分。

结果发现，测量的 27 个 crRNA 切割效率与 CRISPR-kp 预测值相关。与现有的预测工具相比，预测精度高于常用的预测工具Doench Rule Set 2和基于斑马鱼胚胎中sgRNA数据的CRISPRscan评分。

(图3新设计的27crRNA切割效率与预测得分对比)

这项研究使crRNA碱基序列与切割效率之间的关系更加清晰。这一结果预计将有助于基因组编辑技术的进步，不仅适用于斑马鱼，也适用于其他物种和医学应用。

※1 CRISPR-Cas9（成簇规则间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白）
双链断裂（DSB）是新的基因修饰技术“基因组编辑”中使用的主要工具，可以删除、替换或插入基因组序列中的任意位置。 CRISPR-Cas技术于2013年被报道为继ZFN和TALEN之后的第三代基因组编辑工具，由于其易于定制（改变目标基因和靶向多个基因），目前它不仅被迅速用于人类和小鼠等哺乳动物细胞的基因组编辑，而且还被用于细菌、寄生虫和斑马鱼等多种细胞和生物物种的基因组编辑。

[已发表论文]
标题：与野生型或 HiFi Cas9 组装的双引导 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白复合物的 CRISPR RNA 的关键序列特征。
出版期刊：核酸研究
发布日期：2022 年 2 月 15 日
作者姓名：
高知工业大学研究生院硕士课程生命科学课程于 2021 年完成冈田圭太
Kanae Aoki，高知工业大学生命科学课程硕士课程二年级
高知工业大学研究生院硕士课程生命科学课程于 2022 年完成 Teruyuki Tabei
高知工业大学，硕士课程，生命科学课程，二年级，Hirohiro Sugio
高知工业大学研究生院硕士课程生命科学课程于 2021 年完成今井美智
高知工业大学研究生院硕士课程生命科学课程于 2022 年完成 Yuki Bonshihara
Yusuke Kamachi，高知工业大学环境科学与工程系教授
DOI：https://doiorg/101093/nar/gkac100

Keita Okada等人的论文发表在英国科学杂志《Nucleic Acids Research》上

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